近年来，随着饲用抗生素使用的逐步受限，如何保障畜禽健康成为我国畜牧业的一大挑战。玉米和豆粕是目前仔猪生产上主要的饲料原料，而豆粕中的抗原蛋白、胰蛋白酶抑制剂及植酸等抗营养因子会阻碍消化道吸收利用营养物质，不利于动物生长和健康。研究表明，生物发酵能有效降解饲料中的抗营养因子，促进养分的消化吸收，改善动物健康，减少饲用抗生素(促生长)的使用。选取合适的微生物进行饲料的发酵能有效降解饲料中的抗营养因子，促进养分的消化吸收，分泌的代谢产物如小肽，有机酸等利于改善动物健康。
目前乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌被广泛引用于饲料发酵。其中，乳酸菌产生的有机酸、细菌素等代谢产物有利于改善饲料的营养品质，酵母菌能降解豆粕中的水苏糖、棉子糖，而枯草芽孢杆菌对豆粕中抗原蛋白具有较强的降解效果。多菌株混合发酵理论上可以发挥不同菌株的发酵特性，但是不同菌株间存在可能存在拮抗作用，比如，当米曲霉和干酪乳杆菌直接混合发酵豆粕，会降低米曲霉对豆粕中抗原蛋白的降解效果。而采用菌酶协同发酵，可以提高发酵过程中微生物对饲料中大分子物质利用效率，如纤维素酶水解秸杆生成的单糖能为酵母菌合成菌体蛋白提供能量，进而提高饲料品质。
本研究以玉米、豆粕作为主要的发酵原料，通过单菌固态发酵比较不同菌株对饲料成分及营养价值的影响。进一步采用混菌发酵和菌酶协同的方式优化饲料的发酵工艺，制备抗营养因子含量低同时乳酸含量高的生物发酵饲料。随后通过仔猪饲喂实验对比生物发酵复合饲料与并将发酵饲料饲喂仔猪，检验饲料对于仔猪生长性能的影响，为实际生产中的应用提供参考。
1.1 实验材料
实验菌株:枯草芽孢杆菌BS12为本研究室自行分离的菌株，枯草芽孢杆菌CICC20076和枯草芽孢杆菌CICC20070:中国工业微生物菌株保藏管理中心(CICC);粪肠球菌EF(原始编号NCIMB10415):山东某公司;干酪乳杆菌LC和植物乳杆菌LP为本实验室自行分离的菌株;酿酒酵母:中国工业微生物菌株保藏管理中心(CICC);
豆粕:浙江某生物发酵公司。
复合酶制剂:广东某酶制剂公司。
主要仪器:Kjeltec8400全自动凯氏定氮仪:德国FOSS公司;L－8900全自动氨基酸分析仪:日本Hitachi公司;SpectraMax M5酶标仪:美国Molecular Devices公司等。
1.2 实验方法
1.2.1 发酵菌株的筛选
取9g豆粕、9g玉米粉、2g麸皮于100mL三角瓶中搅拌均匀后配成复合饲料，于105℃灭菌15min，按接种量5%别加入枯草芽孢杆菌CICC20076、枯草芽孢杆菌CICC21076、枯草芽孢杆菌BS12、酿酒酵母CICC1520、粪肠球菌EF、干酪乳酸菌LC和植物乳杆菌LP的种子液，同时加入灭菌水至饲料总含水量为45%，发酵体系内菌浓度达到1.0×107CFU/g，搅拌均匀后于37℃恒温培养，进行固态发酵。实验根据菌的种类不同共设7个组，每组3个重复，其中枯草芽孢杆菌CICC20076组、枯草芽孢杆菌CICC21076组和枯草芽孢杆菌BS12组发酵24h，酿酒酵母CICC1520组发酵48h，粪肠球菌EF组、干酪乳酸菌LC组和植物乳杆菌LP组发酵48h。发酵结束后，将发酵饲料于60℃烘干，粉碎过60目筛后，测定发酵饲料中粗蛋白、豆粕抗原蛋白、中性洗涤纤维、酸溶蛋白以及乳酸含量。
1.2.2 混菌发酵菌株配比优化实验
将筛选出了芽孢杆菌BS12与粪肠球菌EF以不同比例添加入复合饲料，添加比如表1所示，按1.2.1方法先进行24h好氧发酵，再进行48h厌氧发酵，选取最优的发酵比例。
1.2.3复合酶制剂对纤维降解效果
为弥补细菌对纤维降解的不足。本研究中采用复合酶(主成分为:纤维素酶、甘露糖酶、果胶酶)强化饲料纤维的降解。分别以质量比0.3%、0.5%、0.7%和1.0%加入复合饲料中，随后经过枯草芽孢杆菌BS12和粪肠球菌EF分步发酵后，测定发酵饲料中中性洗涤纤维含量。
1.2.4 菌酶协同发酵对饲料氨基酸体外消化率的影响
两步酶法测定发酵复合饲料的体外消化率参考Sakamoto等的方法进行。分别取3g发酵复合饲料和未发酵复合饲料，装入150mL三角瓶中。加入30mL 10000U/mL的胃蛋白酶溶液(3000U/mg，Sigma)，用0.05mol/LKCl－HCl缓冲液调整至pH为2.0，随后在39℃，150r/min条件下振荡消化4h。随后用1mol/LNaOH调整溶液pH为7.0，加入150mg胰蛋白酶(250U/mg，Sigma)于39℃，150r/min继续消化4h。最后加入5mL20%的磺基水杨酸溶液终止反应，沉淀30min。消化后的溶液在3000r/min条件下离心15min，弃上清。剩余的残渣在105℃条件下烘干处理4h，获得残渣样本。参照国标《GB/T6432—1994》检测发酵前后饲料中的粗蛋白含量，参照国标《GB/T18246—2000》检测残渣中粗蛋白和氨基酸的含量。体外消化率按照如下的公式计算:
1.3 仔猪饲养实验
1.3.1 发酵饲料的制备
玉米、豆粕和麸皮按45%、45%和10%的比例混合均匀，取200kg的玉米豆粕复合饲料，按5%比例分别接种芽孢杆菌BS12、粪肠球菌EF和5%的复合酶制剂，初始湿度控制在40%左右，室温条件下(30℃)好氧发酵24h后;随后装入厌氧发酵袋，室温条件下厌氧发酵48h后烘干粉碎待用。
1.3.2 动物实验
选取192头体重在(9.35±0.65)kg的49日龄健康仔猪(Duroc×Largewhite×Yorkshire)，随机分配至两个处理组，每个处理6个重复，每个重复16头。处理组1饲喂玉米豆粕基础日粮(对照组)，日粮中添加100mg/kg喹乙醇和50mg/kg吉他霉素;处理组2以10%发酵饲料替代基础日粮中的玉米和豆粕(发酵饲料组)，且日粮中不添加抗生素，实验期为24d。于实验期1d及24d称取仔猪初始体重及末重，每日记录采食量、计算平均日增重。实验日粮组成及营养水平见表2。
1.4 指标测定及方法
饲料中抗原蛋白含量的测定采用龙科方舟试剂盒根据酶联免疫(ELISA)法进行测定;粗蛋白的测定参照《GB/T6432—1994》;粗脂肪的测定参照《GB/T6433—1994》;中性洗涤纤维的测定参照《GB/T20806—2006》;饲料中钙的测定参照《GB/T6436—2002》;总磷的测定参照《GB/T6437—2002》;酸溶蛋白的测定参照Mahmoudreza等的研究;饲料中乳酸采用羟基联苯比色法测定;饲料pH采用pH计直接测定。
1.5 数据统计与分析
采用SPSS19.0对实验结果进行分析处理，采用ANOVA进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著，所有结果均以平均数±标准差表示。
2.1 单菌发酵对饲料营养成分的影响
由表3可知，本实验中枯草芽孢杆菌对复合饲料中的大豆球蛋白和β－伴球蛋白降解程度较强，其中枯草芽孢杆菌BS12的降解能力最高，对大豆球蛋白降解率为87.40%，β－伴球蛋白为76.60%。除此以外，枯草芽孢杆菌发酵后，饲料中酸溶蛋白含量高于其他类型的实验菌株，其中BS12发酵饲料中酸溶蛋白含量最高，提高了4.8倍。而枯草芽孢杆菌对饲料中纤维的降解程度也高于其他菌株。其中枯草芽孢杆菌BS12对中性洗涤纤维的降解率达到30.20%。相较于枯草芽孢杆菌和酵母菌，三株乳酸菌(粪肠球菌EF、干酪乳杆菌LC和植物乳杆菌LP)的产乳酸能力较强，其中，粪肠球菌EF最强，发酵48h后饲料中乳酸含量达到110.53mmol/kg。
为了实现降低饲料抗营养因子，提高饲料乳酸含量的效果，本研究采用枯草芽孢杆菌BS12与粪肠球菌EF进行混菌发酵实验。
2.2 混菌发酵
如表4所示，枯草芽孢杆菌BS12的比例提高有利于提高饲料中抗原蛋白的降解率和酸溶蛋白的含量。尽管粪肠球菌EF的含量减小，饲料中乳酸含量差异并不显著。采用当饲料中总菌量达到1.0×107CFU/g，芽孢杆菌BS12和粪肠球菌比例8∶1时，进行先好氧发酵24h，再厌氧发酵48h，饲料中大豆球蛋白含量减少至8.31mg/g，β－伴球蛋白含量降低至6.44mg/g，酸溶蛋白相较发酵前提高6.16倍，乳酸含量达到116.57mg/g。
2.3 菌酶协同发酵对饲料营养成分的影
由表5可知，添加纤维素酶、甘露糖酶及果胶酶制备的后，发酵饲料中性洗涤纤维降解程度提高。添加量为0.30%、0.50%、0.70%和1.00%时，相较于未发酵饲料，中性洗涤纤维降解率分别为35.41%、39.36%、40.32%和40.61%。但是抗原蛋白降解程度及乳酸含量变化并不显著。
2.4 菌酶协同发酵对饲料氨基酸消化率的影响
由图1可见，经过发酵后，饲料中粗蛋白消化率也得到提高，6种必需氨基酸和5种非必须氨基酸体外消化率得到显著提高。其中，蛋氨酸、苯丙氨酸分别提高15.15%和17.60%，丙氨酸，半胱氨酸，色氨酸分别提高了10.11%、10.05%和9.89%，粗蛋白消化率整体提高6.94%。
2.5 仔猪饲喂效果
由表6可知，相较于添加抗生素的对照组，饲料中添加10%的发酵饲料有利于提高采食量和日增重。较于对照组，发酵饲料组仔猪料肉比和腹泻率相差异并不显著。
通过生物发酵降低饲料中抗营养因子的含量，从而提高动物对饲料养分的消化利用率，已成为饲料工业发展的重要方向。目前研究多为发酵单一原料，如发酵豆粕、发酵菜粕和发酵DDGS。但是对于混合原料发酵的研究并不充分。本研究以玉米、豆粕和麸皮配制成混合原料，采用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、粪肠球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌进行发酵实验，通过比较不同菌株对饲料中抗原蛋白降解程度、纤维降解程度及发酵后饲料中乳酸含量的影响，发现枯草芽孢杆菌对饲料原料中蛋白和纤维的降解程度更高，乳酸菌产乳酸能力更强。Chi等也发现相较于酵母菌和乳酸菌，解淀粉芽孢杆菌对豆粕蛋白的降解程度更高。这可能是由于芽孢杆菌能分泌大量蛋白酶和纤维素酶，对大分子蛋白和纤维降解能力较强。乳酸菌虽然可以发酵产生乳酸，但是在固态发酵中对饲料中抗原蛋白的降解能力不强。
为综合芽孢杆菌对豆粕抗原蛋白的降解特性与乳酸菌的产乳酸特性，本研究选取了枯草芽孢杆菌中对蛋白和纤维降解性较能强的BS12和乳酸菌中产酸能力较强的粪肠球菌EF进行混菌发酵实验。但是，枯草芽孢杆菌为好氧细菌，而粪肠球菌为兼性厌氧细菌，完全进行好氧发酵或厌氧发酵会抑制其中一种菌的生长。Chen等采用分步发酵的方法用米曲霉先降低豆粕中的抗原蛋白，再用干酪乳杆菌发酵提高乳酸含量，降低豆粕pH。曲露等采用先好氧再厌氧的分步发酵方式，先降低菜籽粕中的硫甙和植酸，并提高粗蛋白及小肽含量，再通过厌氧发酵增加有机酸提高风味。本研究采用同步加菌，先好氧发酵24h，再厌氧发酵48h的工艺。分步发酵降低了饲料中的抗原蛋白，且抗原蛋白降解程度和BS12单菌发酵相似，而乳酸含量也与EF单菌发酵结果相当。这说明，分步发酵工艺同样适用于玉米－豆粕型复合饲料的发酵。
饲料原料中含有大量的植物纤维。其中中性洗涤纤维过高会增加食糜黏度，阻碍其在仔猪肠道内的正常推进，增强饱腹感，降低采食量。非淀粉多糖酶有助于分解细胞壁，释放营养成分，提高干物质、有机物及粗蛋白的消化利用率。本研究采用通过添加复合酶对发酵饲料进一步优化。结果显示，发酵过程添加非淀粉多糖复合酶(纤维素酶、甘露糖酶和果胶酶)，进一步降低了饲料中的中性洗涤纤维含量。发酵后，粗蛋白、蛋氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸，半胱氨酸和色氨酸的体外消化率提高明显。其中，蛋氨酸、丙苯氨酸和色氨酸是猪日粮中的必需氨基酸，而半胱氨酸是半必需氨基酸。倪良振等研究发现，在含5.8%酸性洗涤纤维的日粮中添加纤维素酶极显著提高烟台黑猪对蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸的回肠表观消化率。因此，采用非淀粉多糖酶和枯草芽孢杆菌、粪肠球菌协同发酵降解饲料中的大分子蛋白和纤维，产生小分子肽和游离氨基酸，更有利于仔猪对氨基酸的消化利用。
仔猪饲喂实验进一步证明，相较于添加了抗生素的对照组，采用10%的菌酶协同发酵复合饲料有利于提高仔猪生长性能，且料肉比和腹泻率并未发生显著变化。
本研究通过发酵实验筛选了1株高效降解豆粕抗原蛋白的枯草芽孢杆菌BS12和1株产乳酸能力较强的粪肠球菌EF，用于玉米豆粕型复合饲料的发酵。结果显示，将BS12与EF按总菌量1.0×107CFU/g，菌量比8∶1接种于复合饲料，同时接入0.5%的复合酶，发酵72h，可降解饲料中80%的大豆抗原蛋白，且乳酸含量达到122.18mmol/kg。所得发酵复合饲料提高了仔猪采食量和日增重，有利于提高仔猪生长性能，减少饲用抗生素使用。
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